Rab 3A Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402633-ACT

RAB3A codifica la piccola GTPasi Rab 3A, un regolatore dell’esocitosi Ca²⁺-dipendente associato alle vescicole sinaptiche, che coordina l’attracco (docking), la preparazione (priming) e la fusione delle vescicole nelle terminazioni presinaptiche. Alternando ciclicamente gli stati legati a GDP e a GTP, Rab 3A si integra con le reti di effettori Rab e con il macchinario associato alle SNARE per controllare il rilascio di neurotrasmettitori e il traffico vescicolare dipendente dall’attività. Questi processi collegano RAB3A alla segnalazione neuronale, alla plasticità sinaptica e alle vie di secrezione regolata in contesti neuroendocrini. La disregolazione del traffico vescicolare e delle dinamiche di rilascio sinaptico è rilevante per i meccanismi delle malattie del neurosviluppo e neurodegenerative, rendendo RAB3A un bersaglio utile per lo studio della funzione presinaptica.

Rab 3A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RAB3A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Rab 3A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RAB3A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RAB3A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Rab 3A. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RAB3A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Rab 3A nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Rab 3A nelle cellule tumorali con espressione di RAB3A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.