Rab 33B Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404070-ACT

RAB33B codifica a Rab 33B, uma pequena GTPase da família Rab que regula eventos de tráfego de membranas associados ao Golgi e a compartimentos ligados à autofagia. Ao alternar entre os estados ligados a GDP e a GTP, a Rab 33B coordena o brotamento de vesículas, o transporte e o ancoramento/fusão, sustentando a triagem de cargas e a homeostase das organelas. O tráfego dependente de RAB33B cruza vias de macroautofagia e de renovação intracelular de proteínas, processos frequentemente estudados no contexto de neurodegeneração, biologia de infecções e respostas ao estresse em células cancerosas. A interrupção ou desregulação de redes de transporte mediadas por Rab pode perturbar o fluxo da via secretora e a dinâmica autofágica, oferecendo pontos de entrada mecanísticos para pesquisas de biologia celular relevantes para doenças.

Rab 33B O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de RAB33B sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Rab 33B O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus RAB33B em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição RAB33B, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Rab 33B. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus RAB33B nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Rab 33B no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Rab 33B em células tumorais com expressão de RAB33B silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.