Rab 11A Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400617-ACT

RAB11A codifica la piccola GTPasi Rab11A, un regolatore centrale della dinamica degli endosomi di riciclo che coordina la gemmazione delle vescicole, il trasporto e l’ancoraggio alla membrana plasmatica. Rab11A controlla la consegna polarizzata di membrana, il riciclo dei recettori, la citocinesi e la formazione del lume epiteliale interagendo con le proteine della famiglia Rab11 (FIP) e accoppiandosi a motori basati su actina e microtubuli. Attraverso queste funzioni di traffico vescicolare, Rab11A influenza gli output di segnalazione dei recettori di superficie e delle integrine e contribuisce alle decisioni di smistamento endocitico che plasmano migrazione e polarità cellulari. Un riciclo dipendente da Rab11A deregolato è stato associato a fenotipi rilevanti per la trasformazione oncogenica, processi neurodegenerativi e interazioni ospite–patogeno, in cui il traffico di membrana e la compartimentalizzazione risultano alterati.

Rab 11A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RAB11A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Rab 11A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RAB11A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RAB11A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Rab 11A. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RAB11A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Rab 11A nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Rab 11A nelle cellule tumorali con espressione di RAB11A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.