PTEN Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-422475-ACT

Il gene murino Pten codifica PTEN, una fosfatasi lipidica e proteica che contrasta la segnalazione PI3K defosforilando il PIP3, limitando così l’attivazione della via AKT/mTOR e modulando i programmi cellulari di crescita, metabolismo e sopravvivenza. PTEN contribuisce inoltre alla stabilità del genoma, al controllo del ciclo cellulare e alla polarità cellulare attraverso funzioni citoplasmatiche e nucleari che influenzano le risposte al danno al DNA e la regolazione della cromatina. L’alterazione o la ridotta espressione di PTEN è ampiamente associata a una segnalazione proliferativa deregolata e a stati di differenziamento modificati nei diversi tessuti, rendendolo un nodo centrale negli studi sul rimodellamento delle vie oncogeniche. Nei modelli murini, gli effetti del dosaggio di Pten sono spesso utilizzati per interrogare il crosstalk di via con i recettori tirosin-chinasici, la segnalazione MAPK e i segnali provenienti dal microambiente immunitario.

PTEN Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Pten senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PTEN Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Pten nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Pten, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PTEN. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Pten nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PTEN nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PTEN nelle cellule tumorali con espressione di Pten silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.