Prestin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401428-ACT

SLC26A5 codifica prestina, una proteina motrice di membrana simile a un trasportatore di anioni, fortemente arricchita nelle cellule ciliate esterne della coclea, che converte le variazioni del potenziale di membrana in una rapida elettromotilità. Questa trasduzione elettromeccanica sostiene l’amplificazione cocleare e una fine selettività in frequenza, integrando l’omeostasi ionica con cicli conformazionali dipendenti dal voltaggio a livello della membrana plasmatica. L’attività della prestina è collegata ai processi di trasporto ionico epiteliale e alle meccaniche specializzate del citoscheletro e della membrana necessarie per la funzione uditiva. Alterazioni dell’espressione o della funzione di SLC26A5 sono associate a fenotipi di ipoacusia neurosensoriale e rappresentano un punto di accesso molecolare per studiare la biomeccanica delle cellule ciliate e la disregolazione delle vie uditive.

Prestin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SLC26A5 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Prestin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SLC26A5 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SLC26A5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Prestin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SLC26A5 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Prestin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Prestin nelle cellule tumorali con espressione di SLC26A5 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.