PRAME Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404682-ACT

PRAME (antigene espresso preferenzialmente nel melanoma) codifica un antigene cancro-testis che funziona principalmente come regolatore trascrizionale, noto soprattutto per reprimere la segnalazione del recettore dell’acido retinoico e attenuare i programmi di differenziamento guidati dai retinoidi. Modulando la trascrizione dipendente dai recettori nucleari e il relativo controllo epigenetico, PRAME può influenzare la progressione del ciclo cellulare, l’impegno di linea e l’espressione di geni legati all’apoptosi. Un’espressione aberrante di PRAME è stata riportata in molteplici contesti tumorali ed è frequentemente utilizzata come marcatore molecolare in studi sullo stato oncogenico, il riconoscimento immunitario e la plasticità delle cellule tumorali. Nei modelli cellulari umani, la perturbazione di PRAME consente di indagare come reti trascrizionali alterate e segnali di differenziamento contribuiscano a fenotipi maligni e a profili di espressione antigenica.

PRAME Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PRAME senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PRAME Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PRAME nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PRAME, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PRAME. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PRAME nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PRAME nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PRAME nelle cellule tumorali con espressione di PRAME silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.