PPX Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403212-ACT

PPP4C codifica la subunità catalitica della fosfatasi proteica 4 (nota anche come PPX), una fosfatasi serina/treonina che regola reti di segnalazione dipendenti dalla fosforilazione, responsabili del controllo della progressione del ciclo cellulare, dell’organizzazione del centrosoma, della dinamica dei microtubuli e delle risposte al danno al DNA. Tramite l’associazione con subunità regolatorie, PPX modula la selettività per i substrati in vie legate al rimodellamento della cromatina e al controllo dei checkpoint, influenzando la stabilità del genoma e la tolleranza allo stress replicativo. Un’alterata attività di PP4/PPP4C è stata associata a proliferazione deregolata e a un’attenuazione della segnalazione di riparo, rendendola rilevante negli studi di biologia tumorale e di altri disturbi caratterizzati da difetti nelle vie del ciclo cellulare e di risposta allo stress.

PPX Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PPP4C senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PPX Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PPP4C nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PPP4C, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PPX. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PPP4C nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PPX nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PPX nelle cellule tumorali con espressione di PPP4C silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.