PP2Cκ Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-433975-ACT

Ppm1k codifica la fosfatasi mitocondriale PP2Cκ, un enzima della famiglia PP2C dipendente da Mg2+/Mn2+ che regola il metabolismo ossidativo defosforilando bersagli chiave coinvolti nel catabolismo degli amminoacidi a catena ramificata (BCAA). In particolare, PP2Cκ modula l’attività del complesso della deidrogenasi degli α-chetoacidi a catena ramificata (BCKDH), collegando il flusso mitocondriale dei nutrienti all’omeostasi energetica cellulare. Attraverso i suoi effetti sull’utilizzo dei BCAA e sulla funzione mitocondriale, Ppm1k viene studiato in contesti di risposta allo stress metabolico e di bioenergetica specifica di tessuto, inclusi modelli rilevanti per la sensibilità all’insulina, il metabolismo del tessuto adiposo e del muscolo e i fenotipi associati alla disfunzione mitocondriale. La deregolazione di questa via è associata, in sistemi sperimentali, ad alterazioni dell’omeostasi degli amminoacidi e a stati di segnalazione pertinenti alle malattie metaboliche.

PP2Cκ Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Ppm1k senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PP2Cκ Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Ppm1k nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Ppm1k, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PP2Cκ. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Ppm1k nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PP2Cκ nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PP2Cκ nelle cellule tumorali con espressione di Ppm1k silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.