POU3F4 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-422353-ACT

Pou3f4 codifica POU3F4, un fattore di trascrizione POU-homeobox che coordina programmi di espressione genica durante lo sviluppo embrionale, con ruoli di rilievo nel patterning del mesenchima otico e nel neurosviluppo. Legandosi a motivi di DNA simili all’octamero, POU3F4 regola reti trascrizionali specifiche di linea cellulare che influenzano le decisioni sul destino cellulare, la morfogenesi dei tessuti e la tempistica della differenziazione. Nei modelli murini, un’attività alterata di Pou3f4 perturba lo sviluppo dell’orecchio interno e la connettività neuronale, rendendolo pertinente agli studi sulla formazione dei sistemi sensoriali e sul controllo trascrizionale dello sviluppo. La disfunzione dell’ortologo umano è associata a ipoacusia legata al cromosoma X, a supporto di indagini traslazionali allineate su meccanismi conservati della fisiopatologia uditiva.

POU3F4 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Pou3f4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

POU3F4 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Pou3f4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Pou3f4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di POU3F4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Pou3f4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da POU3F4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via POU3F4 nelle cellule tumorali con espressione di Pou3f4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.