POD-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402890-ACT

TCF21 codifica il fattore di trascrizione basic helix–loop–helix (bHLH) POD-1, un regolatore determinante per il destino di linea cellulare che coordina programmi di differenziazione mesenchimale e lo sviluppo d’organo, incluse le linee stromali epicardiche, renali e gonadiche. POD-1 modula reti trascrizionali che intersecano le transizioni epitelio-mesenchimali, il rimodellamento della matrice extracellulare e il controllo del ciclo cellulare attraverso interazioni dipendenti dal contesto con altri fattori bHLH e con vie di segnalazione dello sviluppo. Nei tessuti adulti, un’alterata espressione di TCF21 è collegata a cambiamenti negli stati di attivazione dei fibroblasti e nel rimodellamento dello stroma, influenzando programmi genici rilevanti per l’omeostasi tissutale. La disregolazione di TCF21/POD-1 è stata associata a una riprogrammazione trascrizionale rilevante per il cancro e a fenotipi fibrotici o di rimodellamento, rendendolo utile per lo studio della biologia stromale e delle reti geniche associate alla differenziazione.

POD-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TCF21 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

POD-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TCF21 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TCF21, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di POD-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TCF21 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da POD-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via POD-1 nelle cellule tumorali con espressione di TCF21 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.