plakophilin 3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403614-ACT

PKP3 codifica la plakofillina 3, una proteina con ripetizioni armadillo che si localizza nei desmosomi e sostiene l’adesione cellula-cellula negli epiteli stabilizzando i complessi tra caderine desmosomiali e plakoglobina e collegando gli assemblaggi giunzionali ai filamenti intermedi. Attraverso la regolazione dell’assemblaggio dei desmosomi e del rimodellamento delle giunzioni, la plakofillina 3 contribuisce all’integrità e alla polarità dei tessuti, nonché alle vie di meccanotrasduzione che coordinano l’organizzazione del citoscheletro. Un’espressione alterata di PKP3 o una disfunzione desmosomiale è stata associata a difetti della barriera epiteliale e a fenotipi correlati al cancro, inclusi cambiamenti nei programmi di migrazione e invasione. Queste caratteristiche rendono PKP3 un nodo utile per studiare la biologia delle giunzioni, la segnalazione del citoscheletro e le risposte trascrizionali dipendenti dal contesto agli stimoli di adesione.

plakophilin 3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PKP3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

plakophilin 3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PKP3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PKP3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di plakophilin 3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PKP3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da plakophilin 3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via plakophilin 3 nelle cellule tumorali con espressione di PKP3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.