Pitx2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401426-ACT

PITX2 codifica il fattore di trascrizione umano Pitx2, appartenente alla famiglia paired-like con dominio omeotico, un regolatore chiave della definizione dei pattern di sviluppo e dell’organogenesi. Pitx2 integra segnali a monte mediati da WNT/β-catenina e da vie correlate al TGF-β per controllare programmi trascrizionali che governano la specificazione del destino cellulare, l’asimmetria sinistra-destra e la differenziazione nelle linee oculari, craniofacciali, cardiache e dentali. Un’espressione o una funzione deregolata di PITX2 è associata a malformazioni congenite ed è stata studiata in contesti di regolazione epitelio-mesenchimale aberrante e di reti trascrizionali associate ai tumori. In quanto proteina nucleare legante il DNA, Pitx2 è spesso oggetto di studi relativi all’occupazione di promotori/enhancer, alle interazioni con cofattori e ai circuiti genici a valle che modellano l’identità di linea.

Pitx2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PITX2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Pitx2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PITX2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PITX2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Pitx2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PITX2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Pitx2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Pitx2 nelle cellule tumorali con espressione di PITX2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.