Pinin Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-405373-ACT

O PNN humano codifica a pinina, uma proteína nuclear e associada a desmossomos que conecta a adesão célula–célula em epitélios a programas de transcrição e de processamento de RNA. A pinina participa do splicing de mRNA e de processos relacionados ao complexo de junção de éxons, influenciando os resultados de splicing alternativo e redes de expressão gênica que moldam a diferenciação epitelial e a integridade dos tecidos. Por meio de suas funções na organização desmossomal, nos speckles nucleares e na regulação da maturação de transcritos, o PNN pode modular vias envolvidas em polaridade celular, migração e regulação gênica responsiva ao estresse. Alterações na expressão ou na localização de PNN têm sido associadas a mudanças no fenótipo epitelial e vêm sendo investigadas no contexto da progressão tumoral, de programas transcricionais relacionados à metástase e de outros distúrbios que apresentam desregulação de adesão e de splicing.

Pinin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PNN sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Pinin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PNN em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PNN, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Pinin. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PNN nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Pinin no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Pinin em células tumorais com expressão de PNN silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.