PGD synthase Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405437-ACT

L’HPGDS umano codifica la prostaglandina D sintasi ematopoietica (PGD sintasi), un enzima glutathione-dipendente che converte la prostaglandina H2 in prostaglandina D2 (PGD2). La PGD2 è un mediatore lipidico bioattivo che segnala attraverso i recettori DP1/DP2 ed è ulteriormente metabolizzata in prostaglandine ciclopentenoniche, collegando l’attività di HPGDS al metabolismo degli eicosanoidi, alla segnalazione infiammatoria e a programmi cellulari sensibili allo stato redox. L’espressione di HPGDS è marcata nelle linee immunitarie e mieloidi ed è stata studiata nel contesto dell’infiammazione allergica, delle risposte immunitarie delle vie aeree e della cute e dei processi neuroinfiammatori. Alterazioni del flusso della via della PGD2 possono influenzare il reclutamento dei leucociti, le reti citochiniche e il rimodellamento tissutale, rendendo HPGDS un nodo utile per studi meccanicistici dei fenotipi di malattia associati all’infiammazione.

PGD synthase Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di HPGDS senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PGD synthase Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus HPGDS nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione HPGDS, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PGD synthase. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus HPGDS nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PGD synthase nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PGD synthase nelle cellule tumorali con espressione di HPGDS silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.