Pericentrin 1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403161-ACT

NUP85 codifica una componente centrale del sottocomplesso Nup107–160 del complesso del poro nucleare, supportando il trasporto nucleo-citoplasmatico e mantenendo l’architettura dell’involucro nucleare durante tutto il ciclo cellulare. Grazie ai suoi ruoli nell’assemblaggio del NPC, nella progressione mitotica e nella stabilità del genoma, NUP85 influenza i programmi trascrizionali regolando l’importazione/esportazione nucleare di mediatori di segnalazione e di fattori del ciclo cellulare. L’alterazione dei componenti del poro nucleare è stata collegata a difetti nel processamento dell’RNA, nelle risposte allo stress e a proliferazione aberrante in molteplici contesti patologici, rendendo NUP85 un utile punto di partenza per studiare la regolazione della fisiologia cellulare accoppiata al trasporto. Nei modelli cellulari umani, un’attività alterata di NUP85 può essere analizzata per valutarne gli effetti sul traffico nucleare, sul controllo dei checkpoint e sul rimodellamento delle vie di segnalazione a valle.

Pericentrin 1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NUP85 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Pericentrin 1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NUP85 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NUP85, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Pericentrin 1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NUP85 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Pericentrin 1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Pericentrin 1 nelle cellule tumorali con espressione di NUP85 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.