Pendrin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401272-ACT

Il gene umano SLC26A4 codifica la pendrina, uno scambiatore di anioni multipasso che trasporta cloruro, ioduro, bicarbonato e tiocianato attraverso le membrane epiteliali. La pendrina contribuisce all’omeostasi ionica e del pH nell’orecchio interno, nella tiroide e nel rene, collegando i programmi di trasporto epiteliale all’equilibrio sistemico degli elettroliti. Nella tiroide, la pendrina supporta l’efflusso apicale di ioduro, importante per la gestione dello ioduro, mentre nelle cellule intercalate renali modula lo scambio di bicarbonato e cloruro coinvolto nella regolazione acido-base. Un’attività deregolata di SLC26A4 è associata a deficit uditivi ereditari e a fenotipi correlati alla tiroide, rendendolo un bersaglio utile per studi meccanicistici sul trasporto epiteliale, la biologia dello sviluppo e le relazioni genotipo–fenotipo.

Pendrin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SLC26A4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Pendrin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SLC26A4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SLC26A4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Pendrin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SLC26A4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Pendrin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Pendrin nelle cellule tumorali con espressione di SLC26A4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.