PCTAIRE-3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404867-ACT

CDK18 codifica la chinasi serina/treonina PCTAIRE-3, un membro della famiglia delle chinasi ciclina-dipendenti implicato nella regolazione delle reti di segnalazione e fosforilazione legate al ciclo cellulare. PCTAIRE-3 è stata associata al controllo della proliferazione cellulare e delle vie di risposta allo stress, e si ritiene che la sua attività si integri con cascate di chinasi che influenzano programmi trascrizionali e omeostasi cellulare. Un’espressione o una segnalazione di CDK18 deregolate sono state riportate in studi su disturbi proliferativi e biologia tumorale, a supporto della sua utilità come bersaglio di ricerca per indagare i meccanismi di controllo della crescita e del mantenimento del genoma. La modulazione sperimentale dei livelli di CDK18 può quindi contribuire alla mappatura delle vie coinvolte nella regolazione del ciclo cellulare e in contesti di segnalazione oncogenica.

PCTAIRE-3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CDK18 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PCTAIRE-3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CDK18 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CDK18, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PCTAIRE-3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CDK18 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PCTAIRE-3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PCTAIRE-3 nelle cellule tumorali con espressione di CDK18 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.