PCSK9 Plasmide di attivazione CRISPR (m2): sc-430299-ACT-2

Il gene murino Pcsk9 codifica la proproteina convertasi subtilisina/kexina di tipo 9 (PCSK9), una proteasi serinica secreta che regola l’omeostasi del colesterolo promuovendo la degradazione lisosomiale del recettore delle LDL e modulando così la captazione epatica delle LDL. L’attività di PCSK9 si integra con i programmi di biosintesi lipidica dipendenti da SREBP e influenza il metabolismo sistemico delle lipoproteine, con ulteriori ruoli riportati nella segnalazione infiammatoria e nelle risposte allo stress metabolico. Una funzione deregolata di Pcsk9/PCSK9 è associata all’ipercolesterolemia e a fenotipi rilevanti per l’aterosclerosi, rendendolo un bersaglio ampiamente utilizzato per studi meccanicistici sulla biologia delle malattie cardiovascolari e metaboliche. L’editing genetico di Pcsk9 nel topo consente perturbazioni controllate del turnover dell’LDLR e della gestione dei lipidi per dissezionare le vie di segnalazione, modellare la malattia in vivo e validare modificatori genetici che influenzano i tratti lipidici plasmatici.

PCSK9 Il plasmide di attivazione CRISPR (m2) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Pcsk9 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PCSK9 Il plasmide di attivazione CRISPR (m2) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Pcsk9 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Pcsk9, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PCSK9. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Pcsk9 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PCSK9 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PCSK9 nelle cellule tumorali con espressione di Pcsk9 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.