Pals1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403059-ACT

Il gene umano **MPP5** codifica **Pals1** (protein associated with Lin seven 1), una proteina scaffold che si localizza alle giunzioni serrate (tight junctions) e alla membrana apicale per organizzare la polarità epiteliale. Pals1 agisce all’interno del complesso di polarità **Crumbs** e interagisce con i complessi **PAR** e con le strutture delle tight junctions per coordinare la maturazione delle giunzioni, il traffico vescicolare e la formazione della barriera. Attraverso questi ruoli, MPP5 contribuisce all’architettura tissutale in epiteli e neuroepiteli, e la sua disregolazione viene studiata nel contesto della perdita di polarità, della migrazione cellulare alterata e dell’instabilità giunzionale associate a disfunzione epiteliale e a rimodellamento rilevante in ambito patologico.

Pals1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MPP5 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Pals1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MPP5 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MPP5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Pals1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MPP5 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Pals1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Pals1 nelle cellule tumorali con espressione di MPP5 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.