PAK4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401895-ACT

PAK4 (p21-activated kinase 4) è una chinasi serina/treonina che agisce a valle delle GTPasi Cdc42/Rac per coordinare il rimodellamento del citoscheletro, la polarità cellulare e la dinamica dell’adesione. Modula l’organizzazione dell’actina e il turnover delle adesioni focali tramite la fosforilazione di substrati che influenzano la segnalazione della famiglia Rho, e interagisce con reti associate a MAPK e PI3K/AKT che regolano sopravvivenza e motilità. Nelle cellule umane, un’attività o un’espressione alterata di PAK4 è stata collegata a proliferazione disregolata, fenotipi invasivi e resistenza ai segnali di stress in molteplici contesti patologici. Queste proprietà rendono PAK4 un nodo utile per studiare la segnalazione mediata da chinasi, i programmi di migrazione/invasione e le risposte trascrizionali a segnali provenienti dal citoscheletro.

PAK4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PAK4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PAK4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PAK4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PAK4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PAK4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PAK4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PAK4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PAK4 nelle cellule tumorali con espressione di PAK4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.