p8 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402153-ACT

NUPR1 umano codifica p8, una piccola proteina associata alla cromatina inducibile dallo stress, intrinsecamente disordinata, che regola programmi trascrizionali coordinando l’adattamento al danno cellulare. p8 integra segnali derivanti da stress del reticolo endoplasmatico (ER), stress ossidativo e limitazione di nutrienti per influenzare il controllo del ciclo cellulare, l’apoptosi, l’autofagia e le risposte al danno del DNA, attraverso una modulazione dipendente dal contesto delle reti di fattori di trascrizione. È stata collegata al rimodellamento di vie infiammatorie e metaboliche e a cambiamenti delle caratteristiche epitelio–mesenchimali, a supporto di ruoli nella plasticità cellulare. Un’attività deregolata di NUPR1/p8 è spesso studiata in oncologia e nella patobiologia associata all’infiammazione, dove una tolleranza allo stress e una segnalazione di sopravvivenza alterate contribuiscono a fenotipi rilevanti per la malattia.

p8 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NUPR1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

p8 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NUPR1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NUPR1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di p8. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NUPR1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da p8 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via p8 nelle cellule tumorali con espressione di NUPR1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.