p54/nrb Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-424729-ACT

Il gene Nono del topo codifica p54/nrb (NONO), una proteina nucleare multifunzionale legante RNA e DNA, localizzata nei paraspeckle e coinvolta nella regolazione trascrizionale, nello splicing del pre‑mRNA e nella maturazione dell’RNA. p54/nrb forma complessi con altri membri della famiglia DBHS per coordinare programmi di espressione genica e può influenzare le risposte al danno al DNA tramite ruoli nella riparazione delle rotture a doppio filamento e nel mantenimento della stabilità genomica. Attraverso queste attività, NONO contribuisce al controllo della progressione del ciclo cellulare, della trascrizione adattativa allo stress e dell’architettura nucleare. La disregolazione delle reti di regolazione dell’RNA associate a NONO è stata collegata in letteratura ad alterazioni della segnalazione proliferativa e a stati aberranti di espressione genica rilevanti per la biologia del cancro e per i meccanismi delle malattie neurologiche.

p54/nrb Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Nono senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

p54/nrb Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Nono nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Nono, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di p54/nrb. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Nono nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da p54/nrb nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via p54/nrb nelle cellule tumorali con espressione di Nono silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.