p300 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-435902-ACT

Il gene murino Ep300 codifica p300, un coattivatore trascrizionale ad ampio raggio e una acetiltransferasi della lisina che acetila gli istoni e numerosi substrati non istonici per regolare l’accessibilità della cromatina e i programmi di espressione genica. p300 integra segnali provenienti da vie quali TGF-β/SMAD, Wnt/β-catenina, la segnalazione dei recettori nucleari e le risposte all’ipossia, attraverso interazioni proteina–proteina e il legame a enhancer, plasmando le decisioni di destino cellulare, la proliferazione e le risposte allo stress. L’attività di Ep300 influenza la funzione di enhancer e super-enhancer, le risposte al danno del DNA e le reti trascrizionali infiammatorie, rendendolo un elemento centrale del controllo epigenetico dello sviluppo e dell’omeostasi tissutale. Una acetilazione e coattivazione dipendenti da p300 deregolate sono associate a un’alterata differenziazione e a un riassetto trascrizionale osservati in molteplici contesti biologici rilevanti per la malattia, inclusi modelli di cancro e stati infiammatori.

p300 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Ep300 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

p300 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Ep300 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Ep300, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di p300. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Ep300 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da p300 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via p300 nelle cellule tumorali con espressione di Ep300 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.