P2X3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402380-ACT

Il gene umano **P2RX3** codifica il recettore **P2X3**, un canale cationico attivato dall’ATP altamente arricchito nei neuroni sensoriali periferici, dove media rapide correnti depolarizzanti e l’ingresso di calcio in risposta ai nucleotidi extracellulari. P2X3 partecipa alla neurotrasmissione purinergica e integra segnali di infiammazione e danno tissutale, collegando il rilascio extracellulare di ATP all’eccitabilità neuronale, all’infiammazione neurogena e alla comunicazione sinaptica nelle vie sensoriali. Una segnalazione P2X3 disregolata è stata associata ad alterazioni dell’elaborazione nocicettiva e a fenotipi di ipersensibilità sensoriale, rendendo **P2RX3** un bersaglio utile per studiare l’attivazione neuronale evocata da stimoli e i meccanismi dei circuiti legati al dolore. Questa biologia è rilevante anche per reti di segnalazione più ampie, che coinvolgono canali ionici e vie adiacenti ai GPCR, e che convergono su MAPK, sulla trascrizione dipendente dal calcio e sulla modulazione della funzione dei neuroni sensoriali guidata dalle citochine.

P2X3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di P2RX3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

P2X3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus P2RX3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione P2RX3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di P2X3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus P2RX3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da P2X3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via P2X3 nelle cellule tumorali con espressione di P2RX3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.