p14ARF/p16 Particelle di Attivazione Lentivirale (h): sc-400018-LAC

CDKN2A codifica due proteine oncosoppressori, p16INK4a e p14ARF, prodotte da cornici di lettura alternative che limitano la progressione del ciclo cellulare e coordinano i programmi di senescenza. p16INK4a inibisce CDK4/6 per mantenere RB1 in uno stato ipofosforilato, limitando l’ingresso in fase S dipendente da E2F, mentre p14ARF stabilizza TP53 antagonizzando MDM2 e promuovendo l’arresto del ciclo cellulare o l’apoptosi in risposta a stress oncogenico. Attraverso questi collegamenti con gli assi di RB e p53, CDKN2A integra la segnalazione mitogenica con il controllo dei checkpoint, le risposte al danno del DNA e i cambiamenti trascrizionali associati all’invecchiamento. Un’alterata regolazione di CDKN2A è frequentemente associata a proliferazione deregolata, senescenza compromessa e fenotipi tumorigeni, rendendolo un nodo centrale per studi meccanicistici in biologia del cancro e nel controllo del destino cellulare.

Le particelle di attivazione lentivirale p14ARF/p16 (h) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di CDKN2A in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale p14ARF/p16 (h) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione CDKN2A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di p14ARF/p16. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo CDKN2A e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.