OTUD7B Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403268-ACT

OTUD7B umano codifica un enzima deubiquitinante (contenente un dominio OTU) che scinde le catene di ubiquitina per modulare finemente la stabilità delle proteine e l’ampiezza della segnalazione. OTUD7B è stato collegato alla regolazione di vie immunitarie e infiammatorie, inclusa la regolazione ubiquitina-dipendente di NF-κB e dei complessi di segnalazione prossimali al recettore correlati, contribuendo così a plasmare i programmi trascrizionali a valle. Attraverso i suoi effetti sulla dinamica dell’ubiquitina, OTUD7B influenza processi cellulari quali la terminazione del segnale, le risposte allo stress e la proteostasi. Un’attività o un’espressione di OTUD7B deregolata è stata associata ad alterazioni della segnalazione immunitaria e a fenotipi rilevanti per il cancro, rendendolo un nodo utile per studi meccanicistici sulla regolazione mediata dall’ubiquitina.

OTUD7B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di OTUD7B senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

OTUD7B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus OTUD7B nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione OTUD7B, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di OTUD7B. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus OTUD7B nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da OTUD7B nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via OTUD7B nelle cellule tumorali con espressione di OTUD7B silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.