Plásmido CRISPR de Activación (h) OTUD7B: sc-403268-ACT

El gen humano OTUD7B codifica una enzima desubiquitinante (con dominio OTU) que escinde cadenas de ubiquitina para ajustar finamente la estabilidad de las proteínas y la amplitud de las señales. OTUD7B se ha vinculado a la regulación de vías inmunes e inflamatorias, incluido el control dependiente de ubiquitina de NF-κB y de complejos de señalización proximales al receptor relacionados, moldeando así programas transcripcionales aguas abajo. A través de sus efectos sobre la dinámica de la ubiquitina, OTUD7B influye en procesos celulares como la terminación de la señal, las respuestas al estrés y la proteostasis. La actividad o expresión desregulada de OTUD7B se ha asociado con una señalización inmune alterada y fenotipos relevantes para el cáncer, lo que la convierte en un nodo útil para estudios mecanísticos de la regulación mediada por ubiquitina.

OTUD7B El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de OTUD7B sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

OTUD7B El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus OTUD7B en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional OTUD7B, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de OTUD7B. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo OTUD7B y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de OTUD7B en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía OTUD7B en células tumorales con expresión de OTUD7B silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.