Plásmido CRISPR de Activación (m) OPA1: sc-428749-ACT

El gen Opa1 de ratón codifica la GTPasa mitocondrial tipo dinamina OPA1, un regulador central de la fusión de la membrana mitocondrial interna y de la arquitectura de las crestas. Al controlar la integridad de las uniones de las crestas, OPA1 ayuda a ajustar la eficiencia de la fosforilación oxidativa, el mantenimiento del ADN mitocondrial y la compartimentalización del citocromo c, influyendo así en la susceptibilidad a la apoptosis intrínseca. La función de OPA1 está estrechamente acoplada a las vías de control de calidad mitocondrial, incluido el procesamiento proteolítico dependiente de OMA1/YME1L que equilibra las isoformas largas y cortas de OPA1 durante el estrés. La alteración de la actividad de OPA1 se utiliza ampliamente como punto de entrada mecanístico para estudiar fenotipos de disfunción mitocondrial relevantes para la neurodegeneración, la neuropatía óptica y los modelos de estrés cardiometabólico.

OPA1 El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Opa1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

OPA1 El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Opa1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Opa1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de OPA1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Opa1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de OPA1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía OPA1 en células tumorales con expresión de Opa1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.