OPA1 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-428749-ACT

Mouse Opa1 codifica la GTPasi mitocondriale simil-dinamina OPA1, un regolatore fondamentale della fusione della membrana mitocondriale interna e dell’architettura delle creste. Controllando l’integrità delle giunzioni delle creste, OPA1 contribuisce a modulare l’efficienza della fosforilazione ossidativa, il mantenimento del DNA mitocondriale e la compartimentalizzazione del citocromo c, influenzando così la suscettibilità all’apoptosi intrinseca. La funzione di OPA1 è strettamente collegata alle vie di controllo qualità mitocondriale, inclusa la maturazione proteolitica dipendente da OMA1/YME1L che, durante lo stress, bilancia le isoforme lunghe e corte di OPA1. Un’alterazione dell’attività di OPA1 è ampiamente utilizzata come punto di ingresso meccanicistico per studiare fenotipi di disfunzione mitocondriale rilevanti per neurodegenerazione, neuropatia ottica e modelli di stress cardiometabolico.

OPA1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Opa1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

OPA1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Opa1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Opa1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di OPA1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Opa1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da OPA1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via OPA1 nelle cellule tumorali con espressione di Opa1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.