NPT2b Plasmide di attivazione CRISPR (m2): sc-423004-ACT-2

Nel topo, Slc34a2 codifica la proteina di trasporto del fosfato sodio-dipendente NPT2b (SLC34A2), un cotrasportatore di membrana che media l’assorbimento di fosfato inorganico accoppiato al Na⁺ attraverso le superfici epiteliali e contribuisce all’omeostasi sistemica del fosfato. L’attività di NPT2b collega la disponibilità extracellulare di fosfato al metabolismo del fosforo e a programmi di segnalazione cellulare dipendenti dal flusso di fosfato, inclusi i processi di trasporto epiteliale e le vie legate alla mineralizzazione. Un’alterata funzione di SLC34A2 è associata a una gestione compromessa del fosfato ed è stata implicata in patologie epiteliali, in particolare nella microlitiasi alveolare polmonare, dovuta a un’insufficiente eliminazione del fosfato nel polmone. La perturbazione genetica di Slc34a2 in modelli murini supporta studi meccanicistici sul trasporto ionico epiteliale, sulle reti geniche regolate dal fosfato e sulle conseguenze tessuto-specifiche della disregolazione del fosfato negli epiteli respiratori e in altri epiteli.

NPT2b Il plasmide di attivazione CRISPR (m2) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Slc34a2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

NPT2b Il plasmide di attivazione CRISPR (m2) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Slc34a2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Slc34a2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di NPT2b. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Slc34a2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da NPT2b nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via NPT2b nelle cellule tumorali con espressione di Slc34a2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.