NPAS4 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-432569-ACT

Il gene murino *Npas4* codifica la neuronal PAS domain protein 4 (NPAS4), un fattore di trascrizione bHLH-PAS dipendente dall’attività che collega l’ingresso di calcio ai programmi genici che controllano lo sviluppo delle sinapsi inibitorie e l’equilibrio tra eccitazione e inibizione. NPAS4 regola reti trascrizionali coinvolte nella plasticità sinaptica, nel raffinamento dei circuiti e nel rimodellamento in risposta agli stimoli, integrando segnali provenienti dalla depolarizzazione neuronale e dalle vie a valle associate a CREB. In ambito di ricerca, un’alterata espressione di NPAS4 è stata associata a fenotipi neuropsichiatrici e neurosviluppativi, incluse adattamenti comportamentali legati allo stress, suscettibilità alle crisi epilettiche e disfunzioni cognitive, evidenziandone la rilevanza per i meccanismi di stabilità delle reti neurali. In quanto regolatore a risposta precoce e rapida, NPAS4 è ampiamente utilizzato per studiare come l’attività neuronale rimodelli gli stati trascrizionali e la connettività sinaptica.

NPAS4 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Npas4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

NPAS4 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Npas4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Npas4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di NPAS4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Npas4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da NPAS4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via NPAS4 nelle cellule tumorali con espressione di Npas4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.