Nogo Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400819-ACT

RTN4 codifica Nogo (noto anche come reticulon-4), una proteina associata al reticolo endoplasmatico e alla mielina che modula la crescita dei neuriti, la rigenerazione assonale e la plasticità sinaptica. Le diverse isoforme di Nogo trasducono il segnale attraverso recettori quali NgR1 e co-recettori, influenzando il rimodellamento del citoscheletro dipendente da RhoA/ROCK, il collasso del cono di crescita e le interazioni neurone–glia. Nel SNC, Nogo contribuisce al raffinamento dei circuiti dipendente dall’attività e limita il rimodellamento strutturale dopo una lesione, collegando la regolazione di RTN4 alle vie che governano la connettività neuronale. Alterazioni del segnale e dell’espressione di Nogo sono state studiate in contesti che includono neurotrauma, neurodegenerazione e fenotipi neuropsichiatrici in cui la germinazione assonale e la stabilità delle reti risultano perturbate.

Nogo Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RTN4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Nogo Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RTN4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RTN4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Nogo. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RTN4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Nogo nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Nogo nelle cellule tumorali con espressione di RTN4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.