Nix Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401982-ACT

BNIP3L (Nix) umano codifica una proteina pro-apoptotica associata ai mitocondri, appartenente alla classe BH3-only, che funge da recettore di mitofagia interagendo con le proteine della famiglia LC3/GABARAP tramite il suo motivo LIR. Nix integra il controllo di qualità mitocondriale con la morte cellulare programmata e l’adattamento allo stress, collegando la segnalazione responsiva all’ipossia e la depolarizzazione mitocondriale alla rimozione selettiva dei mitocondri danneggiati. Contribuisce alla maturazione eritroide attraverso la clearance mitocondriale e può influenzare la riprogrammazione metabolica, l’omeostasi delle specie reattive dell’ossigeno e la segnalazione infiammatoria. Un’espressione o un turnover deregolati di BNIP3L/Nix sono stati associati ad alterazioni dei fenotipi di mitofagia e apoptosi riportate in ambiti quali la biologia del cancro, la neurodegenerazione e modelli di stress cardiovascolare, supportando studi meccanicistici sulla disfunzione mitocondriale.

Nix Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di BNIP3L senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Nix Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus BNIP3L nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione BNIP3L, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Nix. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus BNIP3L nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Nix nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Nix nelle cellule tumorali con espressione di BNIP3L silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.