NIRF Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403908-ACT

UHRF2 codifica NIRF, una proteina nucleare multidominio che integra l’attività di ligasi E3 dell’ubiquitina con il riconoscimento del DNA metilato e dei marcatori istonici, al fine di coordinare la regolazione epigenetica. Attraverso i domini ubiquitina-simile, PHD e RING, NIRF contribuisce al rimodellamento della cromatina, al mantenimento della metilazione del DNA e al controllo, legato al ciclo cellulare, dei programmi trascrizionali. Queste funzioni collegano UHRF2 a vie che governano la stabilità del genoma, le risposte al danno del DNA e il controllo della proliferazione, rendendolo rilevante per lo studio di stati epigenetici aberranti nel cancro e in altri disturbi che implicano una regolazione della cromatina alterata. Un’attività alterata di UHRF2/NIRF è stata associata a cambiamenti nei pattern di metilazione dei promotori e al silenziamento o all’attivazione trascrizionale di geni implicati nella trasformazione oncogenica e nella differenziazione.

NIRF Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di UHRF2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

NIRF Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus UHRF2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione UHRF2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di NIRF. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus UHRF2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da NIRF nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via NIRF nelle cellule tumorali con espressione di UHRF2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.