NIK Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400620-ACT

MAP3K14 codifica la chinasi induttrice di NF-κB (NIK), una MAP3K centrale che guida la via non canonica di NF-κB promuovendo il processamento di p100 (NFKB2) in p52 dipendente da IKKα e regolando i programmi trascrizionali di RELB. NIK integra i segnali a valle di recettori quali BAFFR, CD40, LTβR e RANK per controllare l’organogenesi dei tessuti linfoidi, la maturazione delle cellule B, la differenziazione degli osteoclasti e l’espressione di geni infiammatori. Una regolazione rigorosa della stabilità di NIK e dell’ampiezza del segnale è essenziale per l’omeostasi immunitaria, e un’attività deregolata di MAP3K14 è stata associata ad alterazioni della segnalazione NF-κB in disturbi immunologici e infiammatori, nonché in contesti di neoplasie ematologiche. In quanto nodo di segnalazione, NIK viene spesso analizzata per mappare l’accoppiamento tra recettore e trascrizione, il crosstalk tra vie e le risposte adattative allo stress.

NIK Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MAP3K14 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

NIK Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MAP3K14 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MAP3K14, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di NIK. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MAP3K14 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da NIK nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via NIK nelle cellule tumorali con espressione di MAP3K14 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.