Nidogen Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-421895-ACT

Il gene murino Nid1 codifica nidogen (entactina), una glicoproteina fondamentale della membrana basale che fa da ponte tra le reti di laminina e di collagene di tipo IV, stabilizzando l’architettura della matrice extracellulare. Il nidogen sostiene l’adesione cellula–matrice, la compartimentazione tissutale e la presentazione di segnali che influenzano le vie legate alle integrine e ai fattori di crescita, le quali regolano migrazione, polarità e differenziamento. Nel sistema nervoso, Nid1 contribuisce all’integrità delle reti perineuronali e della membrana basale vascolare, con effetti sulla stabilizzazione sinaptica e sulle interazioni neurovascolari. Un’alterata organizzazione della matrice dipendente dal nidogen è rilevante negli studi su difetti dello sviluppo, rimodellamento di tipo fibrotico e comportamento invasivo associato a una dinamica disregolata della matrice extracellulare.

Nidogen Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Nid1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Nidogen Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Nid1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Nid1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Nidogen. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Nid1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Nidogen nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Nidogen nelle cellule tumorali con espressione di Nid1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.