NEGR1 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-435831-ACT

Negr1 codifica neuronal growth regulator 1 (NEGR1), una molecola di adesione cellulare della famiglia IgLON ancorata tramite GPI, arricchita sulla superficie neuronale, dove supporta la crescita dei neuriti, l’organizzazione sinaptica e la maturazione dei circuiti. Nei modelli del sistema nervoso murino, NEGR1 è collegata alla connettività dipendente dall’attività e alla segnalazione nei microdomini di membrana che influenza la guida assonale e la dinamica delle spine dendritiche. Un’alterata espressione di NEGR1 è stata associata a fenotipi neurosviluppativi e neuropsichiatrici, e studi genetici hanno collegato i loci di NEGR1 alla regolazione del peso corporeo e a tratti comportamentali. Queste caratteristiche rendono NEGR1 un nodo utile per studiare la segnalazione mediata dall’adesione, la plasticità strutturale e le relazioni genotipo–fenotipo in contesti di ricerca sul cervello e sul metabolismo.

NEGR1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Negr1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

NEGR1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Negr1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Negr1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di NEGR1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Negr1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da NEGR1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via NEGR1 nelle cellule tumorali con espressione di Negr1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.