NCoA-3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401496-ACT

NCOA3 codifica il coattivatore 3 dei recettori nucleari (NCoA-3, noto anche come SRC-3/AIB1), un coattivatore trascrizionale che coordina programmi di espressione genica responsivi agli ormoni e ai fattori di crescita. NCoA-3 interagisce con recettori nucleari attivati dal ligando e con altri fattori di trascrizione per reclutare enzimi che modificano la cromatina e il macchinario della RNA polimerasi II, plasmando l’accessibilità della cromatina e l’output trascrizionale. Partecipa a vie legate alla segnalazione dei recettori steroidei, alla progressione del ciclo cellulare, al metabolismo e a reti trascrizionali infiammatorie. Alterazioni dell’espressione o dell’attività di NCOA3 sono state associate a un controllo trascrizionale deregolato in molteplici contesti patologici, rendendolo un nodo utile per studi meccanicistici sulla regolazione della trascrizione.

NCoA-3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NCOA3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

NCoA-3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NCOA3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NCOA3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di NCoA-3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NCOA3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da NCoA-3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via NCoA-3 nelle cellule tumorali con espressione di NCOA3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.