NCKX6 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-406101-ACT

SLC8B1 codifica NCKX6, uno scambiatore sodio/calcio dipendente dal potassio che contribuisce all’omeostasi intracellulare del Ca²⁺ accoppiando i gradienti di Na⁺ e K⁺ all’efflusso di Ca²⁺ attraverso le membrane cellulari. Modellando la dinamica del calcio citosolico, NCKX6 può influenzare reti di segnalazione sensibili al calcio che regolano eccitabilità, secrezione e risposte trascrizionali a valle. Un’alterata gestione del Ca²⁺ è ampiamente implicata nelle risposte cellulari allo stress e nella segnalazione disregolata osservata in molteplici contesti rilevanti per la malattia, rendendo SLC8B1 un nodo utile per studi meccanicistici delle vie legate al trasporto ionico. L’analisi della funzione di NCKX6 supporta la ricerca su come i processi di trasporto di membrana si integrino con le vie e i fenotipi dipendenti dal calcio nelle cellule umane.

NCKX6 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SLC8B1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

NCKX6 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SLC8B1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SLC8B1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di NCKX6. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SLC8B1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da NCKX6 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via NCKX6 nelle cellule tumorali con espressione di SLC8B1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.