mTOR Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-425273-ACT

Mtor codifica per la chinasi serina/treonina mTOR, un integratore centrale dei segnali di nutrienti, energia e fattori di crescita che coordina la crescita cellulare, il metabolismo e la sopravvivenza. mTOR opera nei complessi mTORC1 e mTORC2 per regolare la sintesi proteica, l’autofagia, la biosintesi lipidica, l’organizzazione del citoscheletro e la segnalazione insulina/PI3K–AKT attraverso effettori quali S6K e 4E-BP1. Nei modelli murini, la variazione dell’attività della via di mTOR è ampiamente utilizzata per modellare un controllo della crescita deregolato e il rimodellamento metabolico, con rilevanza per la biologia del cancro, le neuroscienze e la funzione delle cellule immunitarie. Poiché mTOR collega i segnali ambientali ai programmi anabolici e catabolici, alterare l’espressione di Mtor è una strategia comune per studiare le risposte allo stress, l’omeostasi mitocondriale e le decisioni sul destino cellulare.

mTOR Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Mtor senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

mTOR Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Mtor nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Mtor, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di mTOR. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Mtor nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da mTOR nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via mTOR nelle cellule tumorali con espressione di Mtor silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.