MRP5 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402443-ACT

ABCC5 codifica il trasportatore umano della famiglia ATP-binding cassette MRP5 (ABCC5), una pompa di efflusso di membrana plasmatica che esporta nucleotidi ciclici come cGMP e cAMP, oltre ad alcuni analoghi nucleosidici e anioni organici selezionati. Controllando i pool intracellulari di nucleotidi ciclici, MRP5 può influenzare le vie di segnalazione cGMP/PKG e cAMP/PKA, con effetti a valle sulla regolazione del tono vascolare, sulla reattività piastrinica e sulle risposte cellulari allo stress. L’espressione di ABCC5 e l’attività del trasportatore vengono spesso studiate nel contesto della gestione degli xenobiotici e dei fenotipi di resistenza multifarmaco, in cui una capacità di efflusso alterata può rimodellare l’esposizione intracellulare a metaboliti e analoghi di farmaci. Una disregolazione di ABCC5 è stata associata a cambiamenti, rilevanti per la malattia, nell’omeostasi della segnalazione e del trasporto, rendendolo un utile bersaglio per studi meccanicistici sulla regolazione mediata dai trasportatori.

MRP5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ABCC5 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

MRP5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ABCC5 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ABCC5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di MRP5. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ABCC5 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da MRP5 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via MRP5 nelle cellule tumorali con espressione di ABCC5 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.