MLH3 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-432245-ACT

Mlh3 codifica a MLH3, um fator de reparo de incompatibilidades (mismatch) do DNA da família MutL que forma um heterodímero com MLH1 e contribui para a manutenção do genoma por meio do reparo de mismatch e da recombinação meiótica. Na meiose, o complexo MLH1–MLH3 promove a formação de crossovers (recombinações) de classe I, enquanto em células somáticas participa da vigilância pós-replicativa que limita o acúmulo de mutações e preserva a estabilidade cromossômica. A MLH3 também interage com vias que respondem ao estresse de replicação e a danos no DNA, conectando a capacidade de reparo à progressão do ciclo celular. Alterações na função de MLH3 têm sido associadas a defeitos de reparo por mismatch, fenótipos de instabilidade genômica e suscetibilidade a processos patológicos impulsionados por mutações, relevantes para a biologia do câncer e para pesquisas em genética reprodutiva.

MLH3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Mlh3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

MLH3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Mlh3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Mlh3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de MLH3. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Mlh3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de MLH3 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via MLH3 em células tumorais com expressão de Mlh3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.