MIST1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402094-ACT

BHLHA15 codifica MIST1, un fattore di trascrizione basic helix–loop–helix che guida la maturazione e l’architettura secretoria nelle cellule esocrine “professionali”, incluse le linee acinari pancreatiche, le cellule principali gastriche e le linee delle ghiandole salivari. MIST1 coordina programmi trascrizionali che supportano l’esocitosi regolata, la polarità apico-basale e l’espansione del reticolo endoplasmatico e della rete di granuli secretori, intersecandosi con vie che regolano l’omeostasi del RE e la differenziazione. Un’attività alterata di MIST1 è stata collegata alla dedifferenziazione delle cellule esocrine, alle risposte di stress degli acini e alla plasticità di linea durante il rimodellamento infiammatorio. Queste caratteristiche rendono BHLHA15 un nodo utile per studiare gli stati di differenziazione epiteliale e la disfunzione dei tessuti secretori, rilevanti per i cambiamenti associati alla pancreatite e per modelli di tumorigenesi pancreatica.

MIST1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di BHLHA15 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

MIST1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus BHLHA15 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione BHLHA15, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di MIST1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus BHLHA15 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da MIST1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via MIST1 nelle cellule tumorali con espressione di BHLHA15 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.