METTL3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404029-ACT

METTL3 codifica il nucleo catalitico del complesso “writer” della N6‑metiladenosina (m6A) dell’mRNA, e in genere agisce insieme a METTL14 e WTAP per depositare m6A su RNA codificanti e non codificanti. Questa modifica epitranscrittomica influenza lo splicing del pre‑mRNA, l’esportazione dell’mRNA, la stabilità e la traduzione, modellando così programmi di espressione genica che controllano la progressione del ciclo cellulare, la specificazione di linea e le risposte adattative allo stress. La marcatura m6A dipendente da METTL3 si interseca con vie che regolano il metabolismo dell’RNA, la biogenesi dei ribosomi e il rimodellamento dei trascritti in risposta ai segnali. Un’attività di METTL3 deregolata e profili di m6A alterati sono stati associati a proliferazione anomala e a stati di differenziamento aberranti in molteplici contesti rilevanti per la malattia, a supporto del suo impiego come nodo meccanicistico negli studi di biologia dell’RNA.

METTL3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di METTL3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

METTL3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus METTL3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione METTL3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di METTL3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus METTL3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da METTL3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via METTL3 nelle cellule tumorali con espressione di METTL3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.