Plásmido CRISPR de Activación (h) METTL3: sc-404029-ACT

METTL3 codifica el núcleo catalítico del complejo “escritor” de N6‑metiladenosina (m6A) en el ARNm, y por lo general funciona junto con METTL14 y WTAP para depositar m6A en ARN codificantes y no codificantes. Esta modificación epitranscriptómica influye en el empalme del pre‑ARNm, la exportación del ARNm, su estabilidad y su traducción, moldeando así programas de expresión génica que controlan la progresión del ciclo celular, la especificación de linajes y las respuestas adaptativas al estrés. El marcado de m6A dependiente de METTL3 se entrecruza con vías que gobiernan el metabolismo del ARN, la biogénesis de ribosomas y la remodelación de transcritos sensible a señales. La actividad desregulada de METTL3 y los cambios en los paisajes de m6A se han relacionado con estados anómalos de proliferación y diferenciación en múltiples contextos relevantes para enfermedades, lo que respalda su uso como nodo mecanístico en estudios de biología del ARN.

METTL3 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de METTL3 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

METTL3 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus METTL3 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional METTL3, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de METTL3. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo METTL3 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de METTL3 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía METTL3 en células tumorales con expresión de METTL3 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.