MDC1 Particelle di Attivazione Lentivirale (h): sc-405652-LAC

Il mediatore del checkpoint 1 del danno al DNA (MDC1) è una proteina nucleare di impalcatura che coordina la risposta al danno al DNA legandosi a γH2AX nei siti di rotture a doppio filamento e amplificando la segnalazione del checkpoint. Attraverso il reclutamento e la stabilizzazione di fattori di riparazione e di segnalazione, tra cui ATM, le ligasi ubiquitina RNF8/RNF168 e complessi associati a 53BP1/BRCA1, MDC1 favorisce il rimodellamento della cromatina, la formazione di foci di danno e una scelta efficiente della via tra giunzione delle estremità non omologhe e ricombinazione omologa. L’attività di MDC1 si interseca con il controllo dei checkpoint del ciclo cellulare e con programmi di mantenimento del genoma che proteggono dallo stress replicativo e dall’instabilità cromosomica. La disregolazione della segnalazione dipendente da MDC1 è stata collegata a una ridotta capacità di riparazione del DNA e a fenotipi di instabilità genomica rilevanti per la biologia del cancro e per la sensibilità ad agenti che inducono danni al DNA.

Le particelle di attivazione lentivirale MDC1 (h) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di MDC1 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale MDC1 (h) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione MDC1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di MDC1. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo MDC1 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.