MCM2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400959-ACT

MCM2 umano codifica una subunità centrale del complesso elicasi MCM2–7, che abilita (licensing) le origini di replicazione e guida lo svolgimento del DNA durante la fase S. La funzione di MCM2 è integrata con l’assemblaggio del complesso di pre-replicazione, il controllo dei checkpoint e le risposte allo stress replicativo coordinate dalla segnalazione ATR/CHK1 per preservare l’integrità del genoma. Un’espressione o un’attività alterata di MCM2 è frequentemente associata a proliferazione aberrante, instabilità genomica e fenotipi di stress replicativo osservati in diversi contesti di cancro e di patologie iperproliferative. In quanto fattore di licensing della replicazione, MCM2 è ampiamente utilizzata per studiare la progressione del ciclo cellulare, la segnalazione del danno al DNA e le dinamiche di replicazione associate alla cromatina.

MCM2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MCM2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

MCM2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MCM2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MCM2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di MCM2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MCM2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da MCM2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via MCM2 nelle cellule tumorali con espressione di MCM2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.