MaxiKα Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402208-ACT

KCNMA1 codifica la subunità α del canale MaxiKα (BK), un canale del K+ ad alta conduttanza attivato da Ca2+ e dal voltaggio, che integra i segnali intracellulari di Ca2+ con la depolarizzazione di membrana per regolare l’eccitabilità cellulare. Modellando la ripolarizzazione del potenziale d’azione e controllando l’afteriperpolarizzazione, MaxiKα influenza il rilascio di neurotrasmettitori, il tono della muscolatura liscia, la secrezione endocrina e la reattività vascolare. Il canale è funzionalmente accoppiato a microdomini di Ca2+ e a vie di segnalazione che modulano il flusso ionico, il potenziale di membrana e l’omeostasi del Ca2+, incluse interazioni con subunità ausiliarie β/γ che ne modulano la cinetica di gating. Un’attività deregolata di KCNMA1 è stata associata a fenotipi di ipereccitabilità neurologica, a disfunzioni della muscolatura liscia vascolare e delle vie aeree e ad alterazioni dei programmi di proliferazione cellulare, rilevanti per la ricerca in elettrofisiologia e nelle canalopatie.

MaxiKα Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di KCNMA1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

MaxiKα Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus KCNMA1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione KCNMA1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di MaxiKα. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus KCNMA1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da MaxiKα nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via MaxiKα nelle cellule tumorali con espressione di KCNMA1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.