MAN1B1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405117-ACT

MAN1B1 codifica la mannosil-oligosaccaride 1,2-α-mannosidasi del reticolo endoplasmatico (MAN1B1), un enzima chiave nel trimming degli N-glicani che contribuisce a indirizzare le glicoproteine mal ripiegate verso la degradazione associata al RE (ERAD). Elaborando i residui di mannosio sugli N-glicani nascente legati all’azoto, MAN1B1 contribuisce al controllo qualità delle glicoproteine, alla proteostasi e al corretto traffico lungo la via secretoria. La deregolazione dell’attività di MAN1B1 è stata collegata ai disordini congeniti della glicosilazione, in cui un’alterata elaborazione degli N-glicani può compromettere la maturazione dei recettori di superficie cellulare, la segnalazione e l’omeostasi intracellulare. Per questo, MAN1B1 è spesso studiato nel contesto delle risposte allo stress del RE, delle dinamiche di ripiegamento proteico e della modulazione della fisiologia cellulare dipendente dai glicani.

MAN1B1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MAN1B1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

MAN1B1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MAN1B1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MAN1B1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di MAN1B1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MAN1B1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da MAN1B1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via MAN1B1 nelle cellule tumorali con espressione di MAN1B1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.