Mad 1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401812-ACT

L’MXD1 umano codifica Mad1, un fattore di trascrizione bHLH-LZ (basic helix-loop-helix leucine zipper) che forma eterodimeri con MAX per antagonizzare l’espressione genica guidata da MYC. Legandosi agli elementi E-box e reclutando complessi corepressori, Mad1 contribuisce a programmi di repressione trascrizionale che promuovono la differenziazione, limitano la proliferazione e influenzano la progressione del ciclo cellulare e l’apoptosi. MXD1 si colloca all’interno della rete regolatoria MYC/MAX/MXD, che integra la segnalazione mitogenica con il controllo della cromatina e della trascrizione. La disregolazione di questo asse è spesso implicata nella biologia dei tumori, rendendo MXD1 un nodo utile per studiare i circuiti trascrizionali oncogenici e gli stati di differenziazione specifici di linea.

Mad 1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MXD1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Mad 1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MXD1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MXD1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Mad 1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MXD1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Mad 1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Mad 1 nelle cellule tumorali con espressione di MXD1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.