LysRS Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404110-ACT

KARS codifica la lisil‑tRNA sintetasi umana (LysRS), un enzima citosolico fondamentale che carica il tRNA^Lys con lisina per garantire la fedeltà della traduzione e una sintesi proteica efficiente. Collegando la disponibilità di amminoacidi alla funzione dei ribosomi, LysRS contribuisce alla proteostasi e alle risposte integrate allo stress ed è stata implicata anche in ruoli di segnalazione non canonici che coordinano l’adattamento cellulare allo stress. Alterazioni dell’attività delle aminoacil‑tRNA sintetasi sono state associate a fenotipi di neurosviluppo e neurodegenerazione, neuropatie periferiche e disturbi mitocondriali/legati alla traduzione, rendendo KARS un nodo rilevante per lo studio delle relazioni genotipo–fenotipo. KARS è quindi ampiamente utilizzato in studi meccanicistici sul controllo della traduzione, sulla regolazione della crescita cellulare e sulle vie associate allo stress.

LysRS Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di KARS senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

LysRS Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus KARS nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione KARS, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di LysRS. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus KARS nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da LysRS nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via LysRS nelle cellule tumorali con espressione di KARS silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.