LGR5 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-420320-ACT

Il gene murino Lgr5 codifica il recettore 5 accoppiato a proteine G contenente ripetizioni ricche in leucina (LGR5), un marker ben consolidato di popolazioni di cellule staminali e progenitrici adulte nelle cripte intestinali, nei follicoli piliferi e in altri epiteli soggetti a rinnovamento. LGR5 potenzia la segnalazione canonica Wnt/β-catenina legando le R-spondine e modulando l’attività di RNF43/ZNRF3, sostenendo il mantenimento delle cellule staminali, la proliferazione e l’impegno di linea. Alterazioni dell’espressione di Lgr5/LGR5 sono state associate a una rigenerazione e a un rimodellamento epiteliali deregolati in contesti infiammatori e neoplastici, rendendolo un nodo utile per interrogare programmi guidati da Wnt. In quanto recettore associato alla “stemness”, LGR5 è frequentemente impiegato per tracciare il potenziale clonogenico e per analizzare le dinamiche di segnalazione dipendenti dalla nicchia.

LGR5 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Lgr5 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

LGR5 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Lgr5 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Lgr5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di LGR5. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Lgr5 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da LGR5 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via LGR5 nelle cellule tumorali con espressione di Lgr5 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.