LC3B Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-417828-ACT

MAP1LC3B codifica la proteina associata ai microtubuli 1, catena leggera 3 beta (LC3B), un modificatore simile all’ubiquitina che viene clivato e lipidato per formare LC3-II sulle membrane autolisosomiali nascenti. LC3B funge da impalcatura centrale dell’autofagia legandosi a recettori del carico contenenti il motivo LIR, come SQSTM1/p62, coordinando così il sequestro selettivo del carico e la maturazione dell’autofagosoma all’interno della via di degradazione lisosomiale. Questa proteina integra segnali nutrizionali e di stress, inclusa l’iniziazione dell’autofagia regolata da MTOR e AMPK, ed è comunemente utilizzata per monitorare il flusso autofagico e la dinamica delle vescicole. Una dis-regolazione dell’autofagia associata a LC3B è stata implicata in contesti quali neurodegenerazione, infezioni e adattamento allo stress delle cellule tumorali, supportando studi meccanicistici sulla proteostasi e sul controllo qualità degli organelli.

LC3B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MAP1LC3B senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

LC3B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MAP1LC3B nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MAP1LC3B, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di LC3B. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MAP1LC3B nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da LC3B nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via LC3B nelle cellule tumorali con espressione di MAP1LC3B silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.